糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，且是多数生物制药的关键成分。作为最广泛和复杂的翻译后修饰之一，蛋白质的糖基化在调节多种生物过程方面具有重要作用。对糖蛋白一级序列的详尽分析，包括糖基化位点的识别与相关聚糖结构的探讨，是理解糖蛋白功能的基础。液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）现已成为蛋白质鉴定和翻译后修饰发现的重要工具。与糖蛋白质组学中普遍采用的数据库搜索策略不同，从头测序是一种创新的方法，无需事先了解DNA或氨基酸序列。然而，糖基化位点的复杂性常常导致序列覆盖的不足，以及游离寡糖修饰谱的不明确，进而使得获得富含信息的糖肽碎裂谱变得困难。这种广泛的糖基化差异，使得一些区域的序列中产生间隙，从而限制了从头测序在一致结构和已知N-链接糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

2025年，期刊JACS Au（IF86）发表了一项名为“解码蛋白糖基化的综合质谱基础从头测序策略”的研究，提出了一种基于质谱的方法来鉴定未知糖蛋白。这一方法结合了糖基释放介导的从头测序和糖基化位点的表征，作者利用N-/O-糖的去糖基化实现了全面的序列覆盖，利用电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术获得高质量的长肽，进一步促进了蛋白质的准确组装。这项技术还成功应用于复杂糖基化的生物制药依那西普及三种新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了其氨基酸序列的微小差异。此外，研究者在亚基、糖肽和聚糖层面上，对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了细致分析。这一策略填补了从头测序与糖基化修饰之间的空白，提供了关于糖蛋白一级结构和糖基化修饰的全面信息。这一方法不仅在基础研究中拥有实用价值，同时也对生物制药行业具有重要的应用潜力。

在研究方法上，作者首先使用N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并配合唾液酸酶，确保去糖基化效果，使用完整质量分析确认去糖基化的有效性，通过EThcD碎裂技术获取高质量的肽段，并采用PEAKS AB进行序列分析。其次，在含有18O的环境中，利用PNGase F酶解将糖基化的Asn转化为Asp并标记18O，进行定量分析。最后，样本使用内切糖苷酶混合物C（EndoCC、EndoS和EndoH）处理，借助pFind分析糖苷酶混合物处理的质谱数据，确认带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，验证N-糖基化位点的识别结果。

在这项研究中，作者设计了一种基于综合质谱的从头解码蛋白质糖基化的方法，利用含有唾液酸化N聚糖和O聚糖的常用模型糖蛋白Fetuin-A（UniProt Accession no P12763）开发了糖蛋白的从头测序策略。通过糖苷酶水解糖苷键，简化质谱分析和肽序列的获取，并通过从头测序过程获得去糖基化蛋白的一级序列。此后，采用高度复杂的糖基化生物制药依那西普验证该方法的有效性。该方法揭示了三种未知TNFR:Fc融合生物制剂的氨基酸序列，并探索它们与原研药物依那西普的相似性。其中的糖基化表征涵盖N-糖基化位点鉴定、游离寡糖分析、糖蛋白亚基分析及糖肽分析，精准定位N/O糖基化位点。

在对依那西普及未知TNFR:Fc融合生物制剂进行从头测序时，结果显示，依那西普具有多个N和O-糖基化位点，通过EThcD碎裂获得的MS/MS谱图实现了该糖蛋白的深度覆盖。对三种新型TNFR:Fc生物制剂的分析揭示了与依那西普的一级序列微小差异，特别是在特定氨基酸位点表现出变异。这种研究的结果为更深入的糖基化特征揭示了新方向。

为了确定N和O糖基化，作者采用了多级分析，包括N-糖基化位点鉴定、游离寡糖分析等，利用PNGase F催化的糖基化位点的18O稳定同位素标记来分析位点。研究表明，通过使用2-AB标记技术，依那西普和三种TNFR:Fc生物制剂的N-糖变体也得到了详细分析。总的来看，该研究提供了全面的信息，不仅解析了氨基酸序列，还识别了糖基化位点，揭示了糖型异质性的复杂情况。基于此，从头测序法在探索糖蛋白的结构、功能及其在生物制药中的应用，展现出巨大的潜力。

在计算生物技术的日益发展背景下，基于质谱的蛋白质从头测序技术为医学和生物制药领域开辟了新的研究途径。通过这一前沿技术，生物制药产业，尤其是在针对糖基化蛋白质的精准分析中，将会产生深远的影响。更多的生物制药公司，例如尊龙凯时(中国区)人生就是搏，将能够应用这一技术以提升治疗药物的有效性，助力患者的健康。